Який найкращий буфер для CO-IP?

Буфери лізису, що не містять миючих засобів, з низьким вмістом солі є популярним вибором для Co-IP розчинних білків. Цей тип лізису найменше порушить будь-які взаємодії білків. Однак для менш розчинних білкових комплексів буфери для лізису можуть містити неіонні детергенти, такі як NP-40 або Triton X-100.

Найбільш часто використовуваними буферами є РІПА та НП-40 обидва вони підходять для лізату цілої клітини/мембранно-зв’язаних білків. Суворі властивості буфера RIPA найкраще підходять для білків, які важко розчинити, тому він є кращим вибором для ядерних і мітохондріальних білків.

Вибір промивного буфера PBS і TBS зазвичай використовуються як промивні буфери, оскільки вони мають фізіологічні концентрації солі та pH. У деяких випадках для зменшення фону можна використовувати помірні коригування концентрації солі в промивних буферах.

Цей детергент допомагає руйнувати ядерні мембрани та додатково розчиняти клітинні та мембранні компоненти, одночасно запобігаючи деградації білка та не перешкоджаючи імунореактивності. Відомо, що буфер RIPA денатурує кінази та запобігає білок-білкові взаємодії, тому є таким не підходить для co-IP.

Коімунопреципітація

1. Виберіть магнітні кульки SureBeads Protein A або Protein G, які відповідають антитілам, які використовуються для IP.
2. Перетрусіть SureBeads, щоб ресуспендувати їх, і перенесіть 100 мкл (1 мг при 10 мг/мл) SureBeads у пробірку.
3. Намагнітіть кульки та викиньте супернатант.
4. Промийте 3 рази 1 мл PBS-T (1x PBS + 0,1% Tween-20).

IP Lysis Buffer — це реагент для лізису цілої клітини ссавців на основі модифікованого буфера RIPA без SDS. Цей буфер для лізису середньої сили ефективно розчиняє клітинні білки, але не вивільняє геномну ДНК і не руйнує білкові комплекси, як звичайний буфер RIPA.