Який принцип подвійного люциферазного аналізу?

Подвійний люциферазний аналіз виконується послідовне вимірювання активності люциферази світлячка та Renilla в тому самому зразку, результати виражені як співвідношення активності люциферази світляка та Renilla (Fluc/Rluc).

Репортерний аналіз люциферази. Коли цей білок активує транскрипцію, клітина буде виробляти фермент люциферазу. Після додавання буфера для лізису та субстрату люмінометр кількісно визначає активність люциферази. Якщо ваш білок активує експресію цільового гена, кількість виробленого сигналу збільшується.

Біолюмінесцентні аналізи АТФ використовують переваги ферментативної реакції люциферази світляків, яка використовує АТФ із життєздатних клітин для генерації фотонів світла. Життєздатні клітини лізують, щоб вивільнити АТФ для виявлення, і додають реагенти, що містять фермент люциферазу світляка та субстрат, щоб каталізувати двоетапну реакцію.

Аналізи люциферази світляків використовує люциферин у присутності кисню, АТФ і магнію для отримання світла (зелений/жовтий, 550-70 нМ), в той час як для аналізу люциферази Renilla (SCT153) потрібні лише коелентеразин і кисень для виробництва світла (синій, 480 нМ).

Аналіз DLR є двоетапна реакція, яка використовує два ферменти люциферази, Firefly і Renilla (Малюнок 1). Ініціюється реакція Firefly, після чого відбувається її гасіння і наступна ініціація реакції Renilla.

Система покладається на два різні репортерні гени, Renilla та люциферазу світлячка, для оцінки регульованої експресії генів. Ген, що кодує люциферазу Renilla, зливається з конститутивним промотором (PGK1 або SPT15) і інтегрується в геном дріжджів у локусі CAN1 як контроль для нормалізації аналізу.